انجام یک تست تشخیصی سریع برای تشخیص گونه های کریپتوسپوریدیوم. در کودکان آفریقایی که با اسهال در بیمارستان بستری شدند

Gédéon Prince Manouana، سرپرستی داده، تحقیق، مدیریت پروژه، نوشتن - پیش نویس اصلی، # 1، 2، 3 Eva Lorenz، سرپرستی داده ها، تجزیه و تحلیل رسمی، نوشتن - بررسی و ویرایش، # 4، 5، 6 Mirabeau Mbong Ngwese، سرپرستی داده ها, اعتبار سنجی , نگارش پیش نویس اصلی , شماره 1, 2 پل آلوین نگوما مور, مدیریت داده ها , نوشتن بررسی و ویرایش , 1 Oumou Maiga Ascofaré , مفهوم سازی , تحلیل رسمی , نوشتن بررسی و ویرایش , 4, 5, 7 Charity Wiafe Aken, گردآوری داده ها , تحقیق , نگارش - بررسی و ویرایش , 7 جان آمواسی , مفهوم پردازی , جذب سرمایه , نگارش - بررسی و ویرایش , 7 Njari Rakotozadrindrainy , Data Curation , Writing - Review & Editing , 8 Raphael Rakotozandriny , Writing & Conceptualizationویرایش، 8 جویس مبوانا، سرپرستی داده، نگارش - بررسی و ویرایش، 9 جان لوسینگو، سرپرستی داده، نگارش - بررسی و ویرایش، 9 ناتالی برن، سرپرستی داده ها، 1، 2 سوفیا ملهم، تحلیل رسمی، 4 ژانوت فریوس زینسو،گزینش داده ها، 1، 2 رومئو بایوده آدگبیت، سرپرستی داده، 1، 2 بندیکت هوگان، تحلیل رسمی، 4 دوریس وینتر، تحلیل رسمی، تحقیق، 4 یورگن می، مفهوم سازی، کسب سرمایه، نگارش - بررسی و ویرایش، 4 پیتر فرنر, مفهوم سازی , جذب سرمایه , نگارش - بررسی و ویرایش , 1, 2, 3, 10 Steffen Borrma, اکتساب سرمایه , نوشتن - بررسی و ویرایش , 1, 2 دانیل ایباخ, مفهوم سازی , تحلیل رسمی , نوشتن - بررسی و ویرایش , #4، 5 و آیولا آکیم آدگنیکا، مفهوم سازی، جذب سرمایه، روش شناسی، اعتبارسنجی، نگارش پیش نویس اصلی # 1، 2، 3، 10، *

گدئون پرنس مانوانا

1 Centre de Recherches Médicales de Lambaréné

2 مرکز آلمانی برای تحقیقات عفونت (DZIF)، موسسه شریک آفریقایی، CERMEL، گابن

3 Institut für Tropenmedizin، دانشگاه توبینگن، توبینگن، آلمان

اوا لورنز

4 اپیدمیولوژی بیماری های عفونی، موسسه پزشکی گرمسیری برنهارد نوچ، هامبورگ، آلمان

5 مرکز آلمانی تحقیقات عفونت (DZIF)، هامبورگ-بورستل-لوبک-ریمز، آلمان

6 موسسه آمار زیستی پزشکی، اپیدمیولوژی و انفورماتیک، مرکز پزشکی دانشگاهی دانشگاه یوهانس گوتنبرگ ماینتس، آلمان

Mirabeau Mbong Ngwese

1 Centre de Recherches Médicales de Lambaréné

2 مرکز آلمانی برای تحقیقات عفونت (DZIF)، موسسه شریک آفریقایی، CERMEL، گابن

پل آلوین نگما مور

1 Centre de Recherches Médicales de Lambaréné

اووموس مایگا اسکافار

4 اپیدمیولوژی بیماری های عفونی، موسسه پزشکی گرمسیری برنهارد نوچ، هامبورگ، آلمان

5 مرکز آلمانی تحقیقات عفونت (DZIF)، هامبورگ-بورستل-لوبک-ریمز، آلمان

7 مرکز تحقیقات مشترک کوماسی در پزشکی گرمسیری ، کوماسی ، غنا

خیریه Wiafe Akenten

7 مرکز تحقیقات مشترک کوماسی در پزشکی گرمسیری ، کوماسی ، غنا

جان امواسی

7 مرکز تحقیقات مشترک کوماسی در پزشکی گرمسیری ، کوماسی ، غنا

رفیق

8 دانشگاه آنتاناناریو ، ماداگاسکار

رافائل راکوتوزاندریندرین

8 دانشگاه آنتاناناریو ، ماداگاسکار

جویس مبانا

9 انستیتوی ملی تحقیقات پزشکی (NIMR) و دانشگاه کپنهاگ ، دانمارک

جان لوسونگو

9 انستیتوی ملی تحقیقات پزشکی (NIMR) و دانشگاه کپنهاگ ، دانمارک

ناتالی بایرن

1 Centre de Recherches Médicales de Lambaréné

2 مرکز آلمانی برای تحقیقات عفونت (DZIF)، موسسه شریک آفریقایی، CERMEL، گابن

سوفیا ملم

4 اپیدمیولوژی بیماری های عفونی، موسسه پزشکی گرمسیری برنهارد نوچ، هامبورگ، آلمان

Jeaot Frejus Zinsou

1 Centre de Recherches Médicales de Lambaréné

2 مرکز آلمانی برای تحقیقات عفونت (DZIF)، موسسه شریک آفریقایی، CERMEL، گابن

Roméo Bayodé Adegbite

1 Centre de Recherches Médicales de Lambaréné

2 مرکز آلمانی برای تحقیقات عفونت (DZIF)، موسسه شریک آفریقایی، CERMEL، گابن

بندیکت هوگان

4 اپیدمیولوژی بیماری های عفونی، موسسه پزشکی گرمسیری برنهارد نوچ، هامبورگ، آلمان

دوریس زمستان

4 اپیدمیولوژی بیماری های عفونی، موسسه پزشکی گرمسیری برنهارد نوچ، هامبورگ، آلمان

یورگن

4 اپیدمیولوژی بیماری های عفونی، موسسه پزشکی گرمسیری برنهارد نوچ، هامبورگ، آلمان

پیتر گوتفرید کرمسنر

1 Centre de Recherches Médicales de Lambaréné

2 مرکز آلمانی برای تحقیقات عفونت (DZIF)، موسسه شریک آفریقایی، CERMEL، گابن

3 Institut für Tropenmedizin، دانشگاه توبینگن، توبینگن، آلمان

10 مرکز تحقیقات عفونت آلمانی (DZIF) ، سایت شریک Tübingen ، آلمان

استیفن بورمن

1 Centre de Recherches Médicales de Lambaréné

2 مرکز آلمانی برای تحقیقات عفونت (DZIF)، موسسه شریک آفریقایی، CERMEL، گابن

دانیل ایباچ

4 اپیدمیولوژی بیماری های عفونی، موسسه پزشکی گرمسیری برنهارد نوچ، هامبورگ، آلمان

5 مرکز آلمانی تحقیقات عفونت (DZIF)، هامبورگ-بورستل-لوبک-ریمز، آلمان

ایولا آکیم آدگنیکا

1 Centre de Recherches Médicales de Lambaréné

2 مرکز آلمانی برای تحقیقات عفونت (DZIF)، موسسه شریک آفریقایی، CERMEL، گابن

3 Institut für Tropenmedizin، دانشگاه توبینگن، توبینگن، آلمان

10 مرکز تحقیقات عفونت آلمانی (DZIF) ، سایت شریک Tübingen ، آلمان

6 موسسه آمار زیستی پزشکی، اپیدمیولوژی و انفورماتیک، مرکز پزشکی دانشگاهی دانشگاه یوهانس گوتنبرگ ماینتس، آلمان

این یک مقاله دسترسی آزاد است که تحت شرایط مجوز انتساب Creative Commons توزیع شده است ، که اجازه استفاده ، توزیع و تولید مثل بدون محدودیت را در هر رسانه ای می دهد ، مشروط بر اینکه نویسنده و منبع اصلی اعتبار داشته باشند.

داده های مرتبط

جدول S1: نسبت مثبت Cryptosporidiu m-PCR و داده های جمعیتی در چهار سایت مطالعه.(docx)

جدول S2: نسبت مثبت Cryptosporidiu m-PCR و داده های جمعیتی در چهار سایت مطالعه.(docx)

داده ها به عنوان اطلاعات اضافی S4 ارسال می شوند.

خلاصه

زمینه

Cryptosporidium یک انگل تک یاخته ای است که باعث ایجاد بیماری اسهال شدید در انسان می شود. تا به امروز ، چندین شرکت تجاری برای تشخیص عفونت Cryptosporidium سیستم ایمنی سریع ایجاد کرده اند. با این حال ، چالش شناسایی یک ابزار تشخیصی دقیق ، ساده و سریع برای برآورد بار کریپتوسپوریدیوز است. این مطالعه با هدف ارزیابی صحت Certest Crypto ، یک آزمایش تشخیصی سریع تجاری (RDT) برای تشخیص آنتی ژن های Cryptosporidium در مدفوع کودکانی که مبتلا به اسهال هستند.

مواد و روش ها

یک مطالعه مقطعی در چهار مکان مطالعه در کشورهای جنوب صحرای آفریقا (گابن ، غنا ، ماداگاسکار و تانزانیا) ، از ماه مه 2017 تا آوریل 2018 انجام شد. نمونه های مدفوع از کودکان زیر 5 سال با اسهال یا سابقه اسهال جمع آوری شدطی 24 ساعت گذشتهتمام نمونه ها با استفاده از Certest Crypto RDT در برابر یک پنل تشخیصی کامپوزیت شامل دو تست واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) (qPCR و RFLP-PCR) به عنوان استاندارد طلا پردازش و مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند.

نتایج

در مجموع 596 نمونه مدفوع جمع آوری شد. ارزیابی RDT حساسیت کلی بسیار کم 49. 6 ٪ (فاصله اطمینان (CI) 40. 1-59. 0) ، ویژگی 92. 5 ٪ (CI 89. 8-94. 7) ، ارزش پیش بینی مثبت 61. 3 ٪ (CI 50. 6-71. 2) وارزش پیش بینی منفی 88. 5 ٪ (85. 3-91. 1) در مقایسه با استاندارد مرجع کامپوزیت qPCR و RFLP-PCR برای تشخیص گونه های Cryptosporidium. علاوه بر این ، عملکرد این آزمایش در سایت های مختلف متفاوت است.

نتیجه

عملکرد ضعیف RDT مورد مطالعه ، نیاز به ارزیابی دقیق RDT های تجاری موجود قبل از استفاده از آنها به عنوان ابزارهای استاندارد در کارآزمایی های بالینی و بررسی جامعه عفونت های Cryptosporidium در گروه های کودکان را نشان می دهد.

خلاصه نویسنده

اسهال یک عامل شایع مرگ در کودکان کمتر از 5 سال است. درمان بر اساس هیدراتاسیون خوراکی و گاهی تجویز آنتی بیوتیک ها انجام می شود. چندین بیماری زایی مسئول اسهال در کودکان کوچک هستند. گونه های Cryptosporidium یکی از پاتوژن های متداول است که باعث اسهال طولانی مدت و مداوم ، سوء تغذیه و نقص رشد در کودکان ایمنی و اسهال شدید در افراد ایمنی بدن می شود.

تشخیص آزمایشگاهی کریپتوسپوریدیوز معمولاً با تشخیص میکروسکوپی اووسیست های Cryptosporidium در نمونه های مدفوع حاصل می شود. تکنیک های رنگ آمیزی شامل لکه های سریع اسید و ایمونوفلورسانس است. با توجه به اینکه درمان مناسب با عدم وجود تشخیص استاندارد به موقع و دقیق در کشورهای متوسط و کم درآمد مانع می شود ، آزمایش های تشخیصی سریع در نقطه مراقبت به طور بالقوه زمان کوتاه تری را برای مراقبت کافی ارائه می دهد. ما یک RDT جدید را هدف قرار داد که گونه های Cryptosporidium را هدف قرار می دهد. این RDT جدید حساسیت متغیر و ناکافی را در بین کودکانی که در بیمارستان مبتلا به اسهال در چهار محل مطالعه مختلف در گابن ، غنا ، ماداگاسکار و تانزانیا پذیرفته شده بودند ، نشان داد.

با این حال ، این RDT جدید نمی تواند به عنوان ابزاری مناسب برای تشخیص قابل اعتماد Cryptosporidiosis برای هدایت برنامه های غربالگری مبتنی بر جامعه مورد استفاده قرار گیرد.

معرفی

بیماری اسهال یک در ده مورد مرگ در کودکان کمتر از پنج سال است [1]. کریپتوسپوریدیوز توسط یک انگل کوکسیدین متعلق به جنس Cryptosporidium ایجاد می شود و به عنوان یکی از مهمترین دلایل بیماری اسهال در سراسر جهان شناخته شده است [2]. چندین گونه از Cryptosporidium در چندین میزبان وجود دارد که می توانند باعث بیماری شوند. اولین گزارش از بیماری انسان در سال 1976 رخ داد ، هنگامی که Cryptosporidium در نمونه های بیوپسی رکتال یک کودک 3 ساله مشخص شد [3-4]. Cryptosporidium parvum و cryptosporidium hominis به عنوان مهمترین دلایل اسهال مداوم در کشورهای در حال توسعه گزارش شده است که به عنوان یک بیماری فرصت طلب در بیماران HIV/AIDS شناخته می شود ، بلکه مسئول شیوع زیاد در افراد ایمنی در کشورهای توسعه یافته است [5-6]. بنابراین Cryptosporidium SPP یک نگرانی بهداشت عمومی به ویژه به دلیل گزارش های مربوط به شیوع در مراکز مراقبت روزانه ، بیماران دارای نقص ایمنی و در انتقال آب در آب است [7-9]. علائم اصلی رمزنگاری Cryptosporidiosis شامل موارد زیر است. اسهال آبکی که ممکن است به وجود بیاید یا طولانی شود ، حالت تهوع ، استفراغ و تب درجه پایین [10-11]. در کشورهای در حال توسعه ، علت های دیگر مربوط به این بیماری شامل سوء تغذیه و نقص رشد در بین کودکان ایمنی بدن و اسهال شدید در افراد مصون ایمنی است [12].

از تکنیک های تشخیصی بی شماری برای تشخیص عفونت Cryptosporidium در انسان و حیوانات استفاده شده است. آنها شامل استفاده از اسمیرهای مدفوع رنگ آمیزی شده توسط روش اصلاح شده Ziehl-Neelsen ، سنجش ایمنی مرتبط با آنزیم (ELISA) و واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) است [13-14]. یک مرور کلی در مورد تشخیص و توصیف مولکولی Cryptosporidium در جای دیگر شرح داده شده است [15]

روشهای ذکر شده در بالا دارای اشکالاتی از قبیل وقت گیر و نسبتاً گران قیمت و همچنین نیاز به آزمایشگاههای مجهز و پرسنل خوب و ماهر هستند [14-16].

برای غلبه بر این محدودیت ها ، تست های مبتنی بر آنتی ژن ها که بیشتر به سنجش های ایمونو کروماتوگرافی تکیه می کنند ، برای تشخیص سریع آنتی ژن های Cryptosporidium به بازار عرضه شده است. RDT ها به طور فزاینده ای به ابزارهای محبوب تبدیل شده اند و برای آزمایش مراقبت بسیار مناسب هستند. آنها امکان تشخیص آنتی ژن های یک یا چند انگل تک یاخته در یک قالب آزمایش واحد را با استفاده از روش ایمونوکروماتوگرافی جریان جانبی فراهم می کنند. مزیت چنین سنجشی این است که آنها سریع ، آسان برای انجام و تفسیر هستند و بنابراین می توان در تنظیمات کم منابع مورد استفاده قرار گرفت. چندین مورد از این RDT ها در طول سالها با حساسیت و ویژگی های مختلف مورد استفاده قرار گرفته اند. در مقایسه عملکرد 4 RDT از جمله ؛ImmunocardStat! CGE ، Crypto/Giardia Duo-Strip ، Rida سریع Cryptosporidium/Giardia/Entamoeba Combi و Giardia/Cryptosporidium quik بررسی نویسندگان از حساسیت های مختلف از 92 تا 100 ٪ و 100 ٪ مشخصات برای همه مارک های RDT برای تشخیص Cryptosporidium در مقایسه باELISA ، میکروسکوپ و qPCR به عنوان استانداردهای طلا [17]. علاوه بر این ، این RDT ها عملکردهای مختلفی را نشان می دهند ، و برخی از آنها به خوبی برای تشخیص گونه های غیر پراو و هومینیس Cryptosporidium کمتر معتبر نیستند [2-18].

The CerTest Crypto is a newly commercialized RDT with manufacturer reported sensitivity and specificity of>به ترتیب 99 ٪ [19]. تاکنون هیچ مطالعه ای عملکرد این RDT را در تنظیمات میدانی از جمله تنظیمات محدود منابع مانند ما ارزیابی نکرده است. علاوه بر این ، بیشتر RDT ها قبل از استفاده باید یخچال و فریزر شوند ، که باعث می شود استفاده از آنها در تنظیمات با درجه حرارت و رطوبت متفاوت استفاده نامناسب یا دشوار باشد. Certest Crypto RDT اما نیازی به تبرید ندارد.

در نتیجه ، به منظور ارزیابی سودمندی تشخیصی آنها ، نیاز به ارزیابی گسترده این RDT در شرایط میدانی متنوع وجود دارد. هدف از این مطالعه ، ارزیابی عملکرد Certest Crypto در برابر استاندارد مرجع کامپوزیت qPCR و RFLP-PCR بود.

مواد و روش ها

طراحی مطالعه ، زمینه و سایت

این مطالعه مقطعی آینده نگر، بخشی از یک مطالعه مقطعی بزرگتر با عنوان "عوامل تعیین کننده ژنتیکی برای انتقال Cryptosporidium parvum / hominis در بین انسان ها و حیوانات در آفریقا" است. این مطالعه از مه 2017 تا آوریل 2018 در چهار کشور آفریقایی زیر صحرا (Lambaréné در گابن، Agogo در غنا، Antananarivo در ماداگاسکار و Korogwe در تانزانیا) انجام شد. همه بیمارستان هایی که شرکت کنندگان در آن ها استخدام شدند، در مناطق نیمه شهری در همه مکان های مطالعه قرار دارند. نمونه های مورد استفاده برای ارزیابی عملکرد تست CerTest Crypto از این مراکز بهداشتی جمع آوری شد.

جمعیت مورد مطالعه

نمونه های مدفوع از همه کودکان زیر 5 سال که با اسهال یا سابقه اسهال در 24 ساعت گذشته به بخش های سرپایی (OPDs) بیمارستان های مورد مطالعه چهار کشور مراجعه می کردند، تهیه شد.

روش های صحرایی و آزمایشگاهی

بیمارانی که نمونه مدفوع و رضایت آگاهانه امضا شده توسط والدین یا قیم قانونی را ارائه کرده بودند در مطالعه وارد شدند. هر کودک یک نمونه مدفوع تازه را در یک ظرف مدفوع خشک و ضد نشت ارائه کرد. قبل از شروع مطالعه، یک آموزش عمومی در تانزانیا با شرکت کنندگان از هر چهار سایت مطالعه برگزار شد. آموزش بر اساس تست CerTest Crypto RDT و qPCR برای کریپتوسپوریدیوم بود. تکنسین های آزمایشگاهی از هر چهار سایت در مورد پردازش نمونه، زمان آزمایش، و پروتکل ها برای استفاده در هر چهار سایت ایجاد و هماهنگ شدند. مراحل عملیات استاندارد (SOPs) برای پردازش و آزمایش نمونه با CerTest Crypto RDT و qPCR در هر چهار سایت اجرا شد. مقدار کمی از نمونه مدفوع (250 میلی گرم یا 250 میکرولیتر) در دمای 20- درجه سانتیگراد برای آنالیزهای بیشتر (با qPCR، RFLP-PCR) نگهداری شد.

پردازش CerTest Crypto RDT

نمونه های مدفوع تازه با استفاده از RDT در دسترس تجاری (Certest Biotec S. L ، Pol. Rio Gallego II ، Zaragoza اسپانیا) مورد آزمایش قرار گرفت. RDT ها طبق دستورالعمل سازنده در دمای اتاق در کلیه سایت ها ذخیره می شدند. نمونه های مدفوع جمع آوری و در جعبه های خنک (4 درجه سانتیگراد) به آزمایشگاه منتقل شد. تمام نمونه ها در طی 24 ساعت از جمع آوری نمونه مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. نمونه های نمونه مدفوع برای تجزیه و تحلیل بیشتر در دمای 80 درجه سانتیگراد ذخیره شدند. تقریباً 125 میلی گرم یا 125 میکرولیتر از نمونه مدفوع با استفاده از یک چوب یا پیپت متقاضی به رقیق تهیه شده توسط سازنده کیت منتقل شد. سیستم تعلیق با لرزش همگن شد. چهار قطره از مواد مدفوع رقیق شده به پنجره مدور کارت تست توزیع شد. این جریان به مدت 10 دقیقه اجرا شد و به دنبال آن تفسیر بصری انجام شد. نتایج آزمون دیرتر از 10 دقیقه طبق دستورالعمل سازنده ثبت نشده است [19].

کیت Certest Crypto با معرفهای کنترل کیفیت تهیه می شود. معرف کنترل کیفیت شامل یک نمونه مثبت و منفی شناخته شده است. یک کنترل منفی و یک مثبت یک بار در ماه در هر چهار سایت و برای هر دسته جدید کیت های آزمایشی اجرا شد. علاوه بر این ، کنترل رویه داخلی در آزمون گنجانده شده است ، که در آن ظاهر یک خط سبز در پنجره نتیجه خط کنترل نشانگر تکنیک صحیح رویه است و تأیید می کند که حجم نمونه کافی استفاده شده است.

انزوای DNA

یک پروتکل استخراج DNA مدفوع MO Bio-Qiagen اصلاح شده شامل شش مرحله اصلی از جمله: درمان نمونه ، لیز سلولی ، حذف مهار کننده ها ، اتصال DNA ، مرحله شستشو و شستشوی DNA انجام شد. DNA ژنومی از 250 میلی گرم (یا 250 میکرولیتر) مدفوع با استفاده از کیت DNeasy Powersoil (Qiagen ، هیلدن آلمان) که قبلاً توسط Mo Bio (Mo-Bio Carlsbad ، CA ، USA) تهیه شده بود ، به عنوان کیت جداسازی DNA Powersoil تهیه شد. تمام مراحل استخراج DNA طبق دستورالعمل سازنده انجام شد. اسیدهای نوکلئیک در 100 میکرولیتر حجم و 5 میکرولیتر از عصاره برای qPCR استفاده شد.

PCR در زمان واقعی

تقویت DNA در یک ابزار q روتور ژن (Qiagen GmbH ، هیلدن-آلمان) در 25 میکرولیتر واکنش با استفاده از کیت مخلوط Master Master Hotstart Taq (Qiagen ، آلمان) ، 3. 5 میلی متر MGCL2 ، 500 نانومتر آغازگر (Crypto-F) 5 انجام شد.'-cgc ttc tct agc ctt tca tg a-3' ، 500 نانومتر آغازگر معکوس (crypto-r) 5'- ctt cac gtg tgt ttg cca at-3 '، پروب کریپتوی 175 نانومتر 5'-rox-cca atc aca gaa tca tca tcaTCA GAA TCG ACT GGT ATC-BHQ2-3 '. توالی های آغازگر و کاوشگر و شماره های مربوطه مربوطه در جای دیگر منتشر شده است [20]. این آغازگرها و توالی های پروب مخصوص Cryptosporidium parvum و c است. Hominis ، اگرچه کارآیی آنها در تشخیص سایر گونه های Cryptosporidium ارزیابی نشده است.

تمام نمونه ها به صورت تکراری برای تشخیص گونه های Cryptosporidium با استفاده از پروتکل دوچرخه سواری زیر مورد آزمایش قرار گرفتند: یک چرخه در دمای 95 درجه سانتیگراد به مدت 15 دقیقه (فعال سازی پلیمراز) و به دنبال آن 45 چرخه 95 درجه سانتیگراد به مدت 15 ثانیه (دناتوراسیون) ، 67 درجه سانتیگراد به مدت 30ثانیه (آنیل شدن) و 72 درجه سانتیگراد به مدت 30 ثانیه (پسوند) و به دنبال آن یک مرحله خنک کننده نهایی در 40 درجه سانتیگراد به مدت 30 ثانیه. پلاسمید ویروس تبخال Phocin (PHHV) در ترکیب اصلی برای کنترل مهار کننده های PCR و فقط نمونه هایی با آستانه چرخه گنجانیده شد<= 38 were considered positive.

ژنوتیپ Cryptosporidium

تمام نمونه ها برای گونه های Cryptosporidium توسط qPCR مثبت تشخیص داده شدند با استفاده از یک روش پلی مورفیسم طول قطعه PC R-striction (RFLP) همانطور که قبلاً توضیح داده شد [21]. برای بهبود ویژگی ، محصولات PCR از هضم محدودیت توالی شدند و توالی های حاصل برای شناسایی گونه های Cryptosporidium منفجر شدند.

تحلیل آماری

تجزیه و تحلیل آماری با استفاده از Stata 14 انجام شد. متغیرهای طبقه بندی به عنوان تعداد و درصد توصیف شدند. متغیرهای مداوم توسط دامنه میانه و بین interquartile (IQR) شرح داده شد. برای اطمینان از یک مجموعه قابل مقایسه از مشاهدات برای تجزیه و تحلیل ، مشاهدات با اطلاعات از دست رفته در مورد RDT یا نتیجه PCR از تجزیه و تحلیل خارج شد و دوره مطالعه از ماه مه 2017 تا آوریل 2018 محدود شد. ما حساسیت ، ویژگی ، ارزش پیش بینی مثبت را محاسبه کردیم(PPV) و ارزش پیش بینی منفی (NPV) برای ارزیابی عملکرد نتیجه Certest Crypto RDT در مقابل نتایج کلی مشاهده شده با ترکیب دو روش PCR (PCR ، RFLP-PCR) تعریف شده به عنوان یک مرجع استاندارد PCR. ویژگی های عملکرد Certest Crypto RDT بر اساس توانایی گواهینامه در تشخیص همه گونه های Cryptosporidium (چه گونه های انسانی و چه از حیوانات) تعیین شد. بنابراین ، برای ارزیابی ویژگی های عملکرد این آزمون برای تشخیص 2 مورد از گونه های شایع (c. hominis و c. parvum) ، هشت مشاهدات که برای "c مثبت بودند. meleagridis "و" ج. Xiaoi / Bovis "از تجزیه و تحلیل خارج شدند. PCR اگر هر دو روش نتیجه مثبتی به دست آورد ، در غیر این صورت منفی بود. اقدامات عملکرد آزمون به عنوان درصد در کنار فاصله اطمینان 95 ٪ مربوطه (CI) ارائه شده است.

تصویب اخلاقی

رضایت آگاهانه از والدین یا سرپرست قانونی بیمار در بخش سرپایی (OPD) یا بخش بستری (IPD) بدست آمد. پروتکل مطالعه توسط هر هیئت بررسی اخلاقی نهادی از هر چهار سایت مطالعه تصویب شد. کمیته ملی اخلاق تحقیقات بهداشت (NATHREC) در تانزانیا ، Comité National d'Hyique du Gabon ، کمیته تحقیقات انسانی ، انتشارات و اخلاق ، دانشگاه علوم و فناوری Kwame Nkrumah ، غنا ، کمیته هماهنگی تحقیقات پزشکی ملی ملیانستیتوی تحقیقات پزشکی ، تانزانیا (NIMR MRCC) ، کمیته اخلاقی وزارت بهداشت جمهوری ماداگاسکار و ärztekammer هامبورگ ، هامبورگ ، آلمان.

نتایج

در مجموع 596 نمونه مدفوع از غنا (N = 132)، گابن (N = 192)، ماداگاسکار (N = 83) و تانزانیا (N = 189) برای ارزیابی عملکرد CerTest Crypto RDT مورد آزمایش قرار گرفت. جدول 1 توزیع فراوانی همه گونه های کریپتوسپوریدیوم را از همه مکان های مورد مطالعه پس از تجزیه و تحلیل با PCR و RFLP ارائه می کند. ویژگی های عملکرد تشخیصی Cryptosporidium CerTest Crypto RDT با استفاده از PCR به عنوان استاندارد مرجع در هر 4 سایت مطالعه مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. جدول 2 حساسیت، ویژگی، PPV و NPV آزمایش را برای شناسایی گونه های کریپتوسپوریدیوم در چهار مکان ارائه می کند. حساسیت آزمون در همه سایت های مورد مطالعه به طور قابل توجهی متفاوت بود و در ماداگاسکار (72. 22%) در مقایسه با گابن و غنا که به ترتیب 50 و 52% داشتند، بیشترین میزان را داشت و در تانزانیا با 35. 29% کمترین میزان بود. برعکس، ویژگی آزمون در همه سایت های مطالعه از 86 تا 94 درصد مشابه بود. با این حال، تجزیه و تحلیل مجدد بعدی منجر به هیچ تغییری در ویژگی عملکرد cerTest در سراسر سایت های مطالعه نشد (جدول 3).

میز 1

جدول 2

نتایج ارزیابی آزمون کلی و خاص کشور از RDT در مقایسه با qPCR و RFLP به عنوان استاندارد مرجع.

جدول 3

نتایج ارزیابی آزمون کلی و خاص کشور از RDT در مقایسه با qPCR و RFLP به عنوان استاندارد مرجع، به استثنای نتایج آزمایش Cryptosporidium meleagridis، "Cryptosporidium xiaoi/bovis".

تجزیه و تحلیل بیشتر از کلیه نمونه های منفی گواهی از کلیه سایتهای مطالعه با استفاده از PCR-RFLP انجام شد.

برای ارزیابی بیشتر ثبات در طول سال و متغیرهای دسته ای از Certest Crypto در برابر استاندارد مرجع PCR ، ما به عملکرد آزمون در طول سال در کلیه سایت های مطالعه نگاه کردیم (شکل (شکل 1 - 4). به طور کلی. موارد کاذب خالص (FN) تقریباً هر ماه در گابن از ابتدا تا پایان دوره مطالعه تشخیص داده شد. در همین حال ، در غنا ، موارد FN بیشتر در 5 ماه اول (مه تا سپتامبر 2017) و سپس در طول2 ماه گذشته (مارس تا آوریل 2018). در حالی که در ماداگاسکار و تانزانیا ، موارد FN بیشتر در ابتدا و به پایان دوره مطالعه یافت می شد. این تعداد FN مشاهده شده در چهار سایت سازگار نیست و نشان نمی دهدیک الگوی واضح برای نشان دادن هرگونه تأثیر دسته ای در عملکرد آزمون از سایت های مختلف مطالعه.

فرکانس ارزیابی آزمایش تشخیصی (RDT در مقابل PCR به عنوان استاندارد مرجع) از کلیه بیماران غنا.

فرکانس ارزیابی آزمایش تشخیصی (RDT در مقابل PCR به عنوان استاندارد مرجع) از کلیه بیماران برای تانزانیا.

فرکانس ارزیابی آزمایش تشخیصی (RDT در مقابل PCR به عنوان استاندارد مرجع) از کلیه بیماران برای گابن.

فرکانس ارزیابی آزمایش تشخیصی (RDT در مقابل PCR به عنوان استاندارد مرجع) از کلیه بیماران برای ماداگاسکار.

سرانجام ، هیچ مدرکی مبنی بر تأثیر جنسیت ، بارندگی ، دوره نمونه برداری و همچنین گروه سنی در عفونت Cryptosporidium در سایت های مطالعه وجود ندارد. با این حال ، بخش زیادی از عفونت Cryptosporidium در دو سال اول کشورهای Accros (جدول S1 و S1 FIG) رخ می دهد.

بحث

There is a need for efficient diagnostic methods for Cryptosporidium infection in settings where the disease is prevalent.consequently, RDTs appear as a unique opportunity for point-of-care diagnosis in the absence of routine stool microscopy and advanced diagnostic tools. CerTest Crypto test is a commercially available RDT that is easy to perform, does not require refrigeration and saves time for the detection of Cryptosporidium spp. According to previous studies, the performance levels’ variability of RDTs can depend on differences in commercial products, dissimilar methodologies employed and genetic diversity of Cryptosporidium across geographical regions [18]. The cerTest Crypto RDT, whose high-performance parameters (Sensitivity and specificity>99 ٪) توسط سازنده ادعا شده است ، در این مطالعه مورد بررسی قرار گرفته است. مشاهدات ما در مورد ویژگی های عملکرد رمزنگاری Certest ویژگی بالایی را نشان داد (جداول (جداول 1 1 و 2). 2). یافته های ما نشان می دهد که این RDT برای تشخیص نمونه هایی با Cryptosporidium قابل اعتماد است. همانطور که در مطالعات قبلی ذکر شد ، این نتیجه همچنین می تواند به معنای عدم واکنش متقابل با سایر عوامل بیماری زا که باعث اسهال می شوند [18-22].

در مقابل ، در هر مکان مطالعه حساسیت های مختلفی وجود دارد ، از 35. 29 ٪ تا 72. 22 ٪ برای تشخیص گونه های Cryptosporidium و از 36. 36 ٪ تا 71. 43 ٪ برای تشخیص C. پاروم و ج. hominisاین نشان می دهد که این آزمایش در تشخیص همه گونه های Cryptosporidium ضعیف عمل می کند. تعداد کلی مثبت مثبت (TP) به طور کلی برای هر چهار سایت کم بود. در همین حال ، تعداد منفی کاذب تا ماه به طور قابل توجهی متفاوت نیست. روند توزیع Cryptosporidium spp. اینکه ما در بین کودکان کوچکتر مشاهده کردیم ، مشابه آن است که توسط جاری و گارسیا در سال 1991 گزارش شده است [23] ، نشان می دهد که جمعیت شناسی نمی تواند بر ویژگی های عملکرد رمزنگاری گواهی (جدول S1) تأثیر بگذارد.

بنابراین ، حساسیت کم مشاهده شده می تواند ناشی از چندین عامل دیگر مانند تراکم انگل کم باشد که در جای دیگر گزارش شده است [24-25]. علاوه بر این ، یافته های ما حساسیت ظاهری کمتری از کیت تست را نشان می دهد که ممکن است در نتیجه مقایسه آزمایش با PCR باشد ، که می تواند DNA انگل باقی مانده را در بیمار پس از عفونت پاک کند ، همانطور که قبلاً توسط Boyce و O'Meara ذکر شددر سال 2017 [24]. برخلاف مطالعه انجام شده توسط Bouyou-Akotet [25] که در آن نویسندگان نشان می دهند که حساسیت کم با بار انگل پایین در یک آزمایش که یک گونه خاص را هدف قرار می دهد ، ارتباط دارد [26] ، یافته های ما حساسیت کلی کمتری با Certest RDT نشان داد کهمخصوص یک گونه خاص نبود.

Furthermore, our finding highlighted the overall decrease in PPV due to the very low number of TP observed from the four sites. Although the NPV of 88.47% can be considered high enough, this is not comparable to manufacturer reported>99 ٪ NPV. تعداد قابل توجهی از FN از کلیه سایتهای مطالعه مشاهده شد. بدون هیچ گونه اطلاعات میکروسکوپی برای ارتباط غلظت اووسیست مشاهده شده (شدت عفونت) و درصد FN ، تعیین تأثیر بار انگل در تشخیص همه گونه های Cryptosporidium دشوار است (جداول 1 و 2). 2)بشرعلاوه بر این ، برخی از ژنوتیپ های Cryptosporodium ممکن است فاقد بخشی یا تمام پروتئین های مورد نظر توسط Certest RDT باشند که می تواند تعداد مشاهده شده FN را توضیح دهد. علاوه بر این ، PPV 61. 29 ٪ به دلیل تعداد بسیار کمی TP و تعداد قابل توجهی از FP مشاهده شده از همه سایت ها است.

ارزیابی حساسیت RDT های مورد استفاده در تشخیص انگل مالاریا گزارش شده است که تحت تأثیر تغییر فصول قرار گرفته است [27]. با توجه به این ، اختلافات مشاهده شده در مورد ما می تواند با نوسان دما در کلیه مناطق مورد مطالعه ارتباط داشته باشد. بنابراین ، بیشتر موارد FN و FP موجود در ماه های مختلف به احتمال زیاد به دلیل بروز کریپتوسپوریدیوز است که با تغییر فصول و در مناطق جغرافیایی متفاوت است. علاوه بر این ، گزارش های دیگر حاکی از آن است که دمای بالاتر از 30 درجه سانتیگراد می تواند بر عملکرد کلی RDT ها [28] در مورد تشخیص انگل مالاریا تأثیر بگذارد. روی هم رفته ، صحت هر نتیجه RDT ممکن است به عوامل مختلفی مانند کیفیت RDT ، ذخیره سازی ، حمل و نقل و عملکرد کاربر نهایی بستگی داشته باشد.

مطالعه ما دو محدودیت اصلی داشت. در مرحله اول ، به دلیل عدم وجود داده های میکروسکوپ در غلظت اووسیست ، ما نتوانستیم با بار Oocyst Cryptosporidium و عملکرد آزمایش ارتباط داشته باشیم. با این حال ، به گفته سازنده ، آزمایش فعلی آنتی ژن های غلظت کم در مدفوع را تشخیص نمی دهد. از این رو نمونه ای که با RDT منفی آزمایش می کند بعید است که از نظر میکروسکوپی مثبت باشد. روی هم رفته ، ما نتوانستیم علت تمام FN گزارش شده از همه سایت های مطالعه را گزارش کنیم. ثانیاً ، بدون هیچ گونه تحقیقات اضافی در مورد پاتوژن های تک یاخته که باعث اسهال می شوند ، ما نمی توانیم احتمال وجود گونه های واکنش متقابل را به عنوان علت کلیه موارد FP در این مطالعه حذف کنیم. داده های جمعیتی ما هیچ مدرک قابل توجهی در مورد تأثیر دما و رطوبت در کیت آزمون ارائه نداد. بنابراین تغییر در عملکرد کیت آزمون که در این مطالعه مشاهده کردیم مربوط به کنترل و ذخیره کیت ها نیست.

در پایان ، Certest Crypto RDT برای تشخیص گونه های Cryptosporidium طراحی شده است. اگرچه این روش تشخیص کپروانیایی سریع است ، اما حساسیت آن برای تشخیص SPP Cryptosporidium و همچنین C کم است. پاروم و ج. به ویژه hominis. بنابراین ، تحقیقات اضافی برای ارزیابی عملکرد Certest Crypto RDT با تأکید ویژه بر عفونت های شدت نور مورد نیاز است که به موجب آن غلظت آنتی ژن های موجود در نمونه زیر حد تشخیص آزمایش است که ممکن است منجر به افزایش تعداد منفی کاذب شود.