روشهای تعیین محدودیت تشخیص و حد کمیت در PCR در زمان واقعی کمی (qPCR)

ساخت وبلاگ

این یک مقاله دسترسی آزاد تحت مجوز CC توسط NC-ND (http://creativeecommons.org/licenses/by-nc-nd/4. 0/) است.

خلاصه

واکنش زنجیره ای پلیمراز کمی در زمان واقعی ، که به عنوان qPCR شناخته می شود ، حساس ترین و خاص ترین تکنیکی است که برای تشخیص اسیدهای نوکلئیک داریم. حتی اگر بیش از 30 سال است که وجود دارد و در برنامه های تحقیقاتی ارجح است ، اما هنوز در تمرین روتین پذیرش گسترده ای را کسب نکرده است. این نیاز به وسیله ای برای ارزیابی بدون ابهام عملکرد تجزیه و تحلیل qPCR خاص دارد. در اینجا ما روش هایی را برای تعیین حد تشخیص (LOD) و حد کمیت (LOQ) مطابق با qPCR ارائه می دهیم. اینها بر اساس روشهای آماری استاندارد است که توسط نهادهای نظارتی سازگار با qPCR توصیه می شود و با یک رویکرد جدید برای برآورد دقت LOD تکمیل می شود.

واژه‌های کلیدی: حد تشخیص ، حد کمیت ، LOD ، LOQ ، نرم افزار GENEX ، PCR در زمان واقعی ، qPCR ، تجزیه و تحلیل داده ها ، تکرار ، MIQE ، کنترل کیفیت ، استاندارد سازی

1. معرفی

احتمالاً در بین مهمترین پارامترهای عملکردی برای یک روش تشخیصی موارد مربوط به حداقل میزان هدف است که می تواند شناسایی و اندازه گیری شود [11]. پارامترهای توصیف شده از این خصوصیات به عنوان حد تشخیص "LOD" و حد کمیت "LOQ" شناخته می شوند. تعاریف آنها در بین نهادهای نظارتی و سازمان های استاندارد کمی متفاوت است [1]. به عنوان مثال ، موسسه استانداردهای آزمایشگاهی بالینی (www. clsi.org) ، LOD را به عنوان "کمترین میزان آنالیت (اندازه گیری) در نمونه ای تعریف می کند که با احتمال (بیان شده) قابل تشخیص است ، اگرچه شاید به عنوان یک مقدار دقیق اندازه گیری نشود"[2]در بسیاری از آزمایشگاه های بالینی و کاربردهای تشخیصی ، از LOD به صورت متقابل به "حساسیت" ، "حساسیت تحلیلی" و "حد تشخیص" استفاده می شود. با این وجود ، این ممکن است گیج کننده باشد زیرا "حساسیت" نیز به روش های دیگر استفاده می شود. به عنوان مثال ، در برخی از برنامه ها "حساسیت" به شیب منحنی کالیبراسیون اشاره دارد ، که تعریفی است که توسط اتحادیه بین المللی شیمی خالص و کاربردی (IUPAC) استفاده می شود. CLSI LOQ را به عنوان "کمترین میزان اندازه گیری در نمونه ای که می تواند با دقت قابل قبول تعیین شود و در شرایط آزمایشی بیان شده بیان شده است ، تعریف می کند" [2]. LOQ جایگزین مبتنی بر حساسیت و ویژگی بالینی برای اهداف تشخیصی ارائه شده است [17].

تعاریف توسط CLSI

LoD = کمترین مقدار آنالیت (اندازه گیری) در یک نمونه که می تواند با احتمال (بیان شده) شناسایی شود، اگرچه شاید به عنوان یک مقدار دقیق کمی سازی نشده باشد.

LoQ = کمترین مقدار اندازه گیری در یک نمونه است که می توان به صورت کمی با دقت قابل قبول تعیین کرد و با دقت قابل قبول در شرایط آزمایشی اعلام شده بیان کرد.

تا حد زیادی اکثر تکنیک های اندازه گیری یک پاسخ سیگنالی را تولید می کنند که متناسب با مقدار اندازه گیری موجود است. به عنوان مثال، جذب اندازه گیری شده متناسب با غلظت اندازه گیری است که توسط قانون بیر-لامبرت پیش بینی شده است. اندازه‌گیری‌های خطی معمولاً یک سیگنال پس‌زمینه تولید می‌کنند که در غیاب اندازه‌گیری مشاهده می‌شود و باید از مقادیر اندازه‌گیری شده کم شود. این سیگنال پس زمینه حساسیت اندازه گیری را محدود می کند و برای تخمین LoD استفاده می شود [3]. با اطمینان 95٪، حد "LoB" خالی عبارت است از:

جایی که σ انحراف معیار است، و

این همچنین برآوردهای توصیه شده در دستورالعمل CLSI EP17 [2] است. σ در معادلات.(1) و (2) به انحراف استاندارد واقعی اشاره دارد، در حالی که SD به انحراف استاندارد تخمینی از آزمایش ها اشاره دارد. جایگزینی σ برای SD مستلزم جایگزینی 1. 645 برای مقدار t مربوطه است که به درجه آزادی و در نتیجه تعداد تکرارهای انجام شده بستگی دارد.

معادلات بالا فرض می کنند که پاسخ خطی است و داده ها در مقیاس خطی توزیع شده اند. انحرافات کوچک از توزیع نرمال هنگام تخمین SD مورد بحث قرار گرفته است [12] اما در qPCR، حتی پاسخ خطی نیست. مقادیر Cq اندازه گیری شده متناسب با پایه log 2 (log2) غلظت اندازه گیری (یا تعداد مولکولهای هدف موجود) ، که یک پاسخ لگاریتمی است. این پیامدهای چشمگیری در تجزیه و تحلیل و تفسیر داده ها دارد [4]. به عنوان مثال ، هنگامی که یک نمونه منفی اندازه گیری شود ، هیچ مقدار CQ به دست نمی آید ، زیرا پاسخ هرگز به خط آستانه نمی رسد ، و انحراف استاندارد (SD) برای هر مجموعه ای که شامل نمونه های منفی باشد نمی تواند محاسبه شود. از این رو ، تخمین LOD و LOQ با رویه های استاندارد فوق امکان پذیر نیست. عارضه بیشتر این است که تخمین فواصل اطمینان ، توزیع عادی را فرض می کند. در حالی که داده های خطی اغلب به طور معمول در مقیاس خطی توزیع می شوند ، داده های qPCR توزیع عادی را در مقیاس لگاریتمی نشان می دهند ، و بیشتر رویکردهای معمولی را رد می کنند. برای برآورد LOD در qPCR ، باید به تعریف LOD در این مقاله برگردیم. ما روش را برای تعیین تجربی LOD بر اساس تکرارهای نمونه و همچنین یک روش جدید برای برآورد اعتماد به نفس LOD ارائه می دهیم. ما همچنین روش تخمین LOQ یک سیستم qPCR را ارائه می دهیم.

2. مواد و روشها

روش qPCR که به عنوان نمونه برای ارزیابی عملکرد مورد استفاده قرار می گیرد ، معتبر بود [5] ، که یک روش مبتنی بر پروب بهینه شده است که یک مکان بسیار محافظت شده و غیر توصیف شده موجود در یک نسخه در هر ژنوم انسانی هاپلوئید را هدف قرار می دهد. مواد آزمایشی DNA ژنومی انسانی (CAT# CHG50 ، TATAA Biocenter) در برابر انستیتوی ملی استانداردها و فناوری (NIST) استاندارد اندازه گیری DNA انسانی (SRM 2372) کالیبراسیون شد. یک سری رقت 2 برابر با پوشش مولکول 1 تا 2048 در هر حجم واکنش تهیه شد. هر نمونه استاندارد در 64 تکرار ، به جز رقیق ترین نمونه ، که در 128 تکرار مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت ، مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. از آزمون Grubb [13] برای شناسایی 9 دور خارج از کشور استفاده شد و 759 نقطه داده برای تجزیه و تحلیل باقی مانده است.

در واکنش qPCR ، Tataa Probe Grandmaster Mix L-Rox استفاده شد و غلظت نهایی روش معتبر در واکنش 200 نانومتر از یک پروب با برچسب FAM و 400 نانومتر از هر آغازگر بود. Intelliqube* 1 (LGC Douglas Scientific) برای کلیه توزیع نمونه و مخلوط کارشناسی ارشد ، دوچرخه سواری حرارتی و تشخیص فلورسانس در زمان واقعی ، با استفاده از حجم واکنش 1. 6 میکرولیتر استفاده شد. پروتکل qPCR 2 مرحله ای شامل یک مرحله فعال سازی آنزیم 1 دقیقه در 95 درجه سانتیگراد و به دنبال آن 50 چرخه 10 ثانیه در 95 درجه سانتیگراد و 30 ثانیه در دمای 60 درجه سانتیگراد بود. هنگام ترسیم منحنی های تقویت ، از یک روش بوتلینینگ خودکار استفاده شد. مقادیر CQ با تنظیم دستی خط آستانه در منطقه تقویت نمایی در تمام توطئه های تقویت با نرم افزار Intelliqube محاسبه شد.

داده های CQ از Intelliqube از پیش پردازش و با استفاده از GENEX (تجزیه و تحلیل های چند جانبه AB) مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند.

ضریب تغییر به این صورت محاسبه شد:

با فرض توزیع log-normal غلظت های تکثیر [6]. این از این واقعیت نتیجه می گیرد که اگر متغیر تصادفی X دارای توزیع lognormal باشد ، با تعریف LN (x) به طور معمول با مثلاً μ و انحراف استاندارد σ توزیع می شود. عملکرد توزیع x سپس توسط

جایی که φ تابع توزیع توزیع عادی استاندارد است. عملکرد چگالی احتمال x به راحتی به عنوان F ′ (x) بدست می آید که از آن میانگین E μ + σ 2 /2 و واریانس (E σ 2 - 1) E 2 μ + σ 2 از x با ادغام به دست می آید. ضریب تغییر به عنوان نسبت بین انحراف استاندارد و میانگین ، یعنی ضریب تغییر x E σ 2 - 1 تعریف می شود.

مقادیر CQ در غلظت های مختلف ، c اندازه گیری شدمن، i = 1 ،… ، p ، با n ماکت در هر غلظت. برای سادگی ارائه n ثابت نگه داشته می شود. تجزیه و تحلیل داده های زیر برای تعمیم در مورد مواردی که تعداد ماکت های مختلف برای غلظت های مختلف وجود دارد ، ساده است. مقادیر CQ حاصل در یک ماتریس داده (C q) ترتیب داده می شودمن ، جi = 1 ،… ، p j = 1 ،… ، n و یک عملکرد نشانگر

جایی که جاییک مقدار برش مشخص شده توسط کاربر است. بگذارید z i = ∑ j = 1 n i i ، j تعداد مقادیر شناسایی شده در غلظت c باشدمنبشرمدل رگرسیون لجستیک فرض می کند که z مشاهده شدهمنبه صورت دوتایی توزیع می شود ، b i n (n ، fمن)، با

جایی که xمنورود به سیستم را نشان می دهد2جفمنبشردو پارامتر ناشناخته β0و β1با برآورد حداکثر احتمال (ML) تقریب می یابد. عملکرد احتمال دارد

جایی که y 1 = ∑ i = 1 p z i و y 2 = ∑ i = 1 p z i x i و φ = 1 p n ln 1 + e β 0 + β 1 x i. تنظیم مشتقات L با توجه به β0و β1به صفر سیستم معادلات را برای برآورد ML می دهد ،

این سیستم غیرخطی معادلات با استفاده از یک روش شبه نیوتن توسط Genex 6 [11] حل می شود. محلول ML توسط β ˆ 0 و β ˆ 1 مشخص می شود. منحنی رگرسیون لجستیک با ترسیم بدست می آید

در مقابل x = log2ج. با توجه به HAT نشان می دهد که t ˆ برآورد ML از t = 1 1 + E-β 0-β 1 x است. مقادیر مشاهده شده y1و y2می تواند به عنوان نمونه از یک متغیر تصادفی در نظر گرفته شود (y1، y2) با عملکرد توزیع ∼ E β0حرف1+ β1حرف2- φ. لحظات (y1، y2) از نظر مشتقات جزئی φ با توجه به β به دست می آیند0و β1، با تمایز وضعیت عادی سازی

با توجه به β0و β1بشرC در اینجا یک حالت عادی سازی است. تخمین ML β ˆ 0 و β ˆ 1 و از این رو ، مقدار علاقه t ˆ ، می تواند به عنوان نمونه ای از متغیرهای تصادفی که به آنها بستگی دارد تعبیر شود (y1، y2) از طریق معادلات ML. خطای استاندارد برای t ˆ توسط

در این فرمول ، و در فرمول های زیر ما از کنوانسیون استفاده می کنیم ، محدودیت های جمع برای همه شاخص ها 0 و 1 است ، و این عبارت در پارامترهای تخمین زده شده ML β ˆ 0 و β ˆ 1 ارزیابی می شود.

فاصله اطمینان 1-2 α α T ˆ ∓ Z α σ ˆ ، که در آن Zαیک درصد از توزیع عادی است ، با افزایش اندازه نمونه N ، فاصله اطمینان دقیق با دقت O ( N-1/2) تقریب می یابد. فواصل اعتماد به نفس بوت استرپ پارامتری (EFRON [7] ، Diciccio و EFRON [8]) با در نظر گرفتن لحظات بالاتر در تقریب طبیعی ، در فواصل استاندارد بهبود می یابند. انواع مختلفی از فواصل اعتماد به نفس bootstrap وجود دارد ، اما همه آنها فاصله اطمینان دقیق را با دقت O ( N-1) تقریبی می کنند. GENEX فاصله اطمینان ABCQ را که در DICICCIO و EFRON 1982 شرح داده شده است ، پیاده سازی می کند. ABC مخفف فاصله اطمینان تقریبی بوت استرپ است ، و اشتراک Q نشان دهنده فرم درجه دوم است. فرمول برای فاصله اطمینان ABCQ است

عبارت qα -مشابه اما با z استαجایگزین شده است - zαبشرسه پارامتر A ، Cسعدی، و Z0به شرح زیر تعریف شده اند. شتاب ،

جایی که حدود جمع بندی برای همه شاخص ها 0 تا 1 است. مشتقات در مقادیر تخمین زده شده ML β ˆ 0 و β ˆ 1 ارزیابی می شوند. ضریب درجه دوم

c q = 1 2 σ ˆ 3 ∑ i ، j ، k ، l ∂ 2 ∂ β β β β β β q ∂ 2 φ ∂ β j ∂ β l ∂ 2 t ∂ y i ∂ y y j ∂ y y k ∂ t ∂ y l l

و اصلاح تعصب

جایی که φ تابع توزیع توزیع عادی استاندارد است. پارامتر γ ˆ توسط تعریف شده است

برآورد تعصب کجاست

Efron [7] ، [8] از فرمول استفاده مکرر می کند

برای بازنویسی بخش هایی از عبارات برای A ، Cسعدی، و b ˆ به عنوان مشتقات جهت دار. تقریب مشتق جهت دار با تمایز عددی از نظر محاسباتی کارآمد است و از عبارات احتمالاً طولانی به دست آمده با انجام تمایز دقیقاً جلوگیری می کند.

3. نتایج

با شروع از یک نمونه ژنوم انسانی کالیبره شده (NIST SRM 2372) ، یک سری رقیق 2 برابر از نمونه های استاندارد تهیه شده است که شامل محدوده 1-2048 مولکول در هر حجم واکنش است. هر نمونه استاندارد در 64 تکرار ، به جز رقیق ترین نمونه ، که در 128 تکرار مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت ، مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. آزمون Grubb نه مساحت را مشخص کرد که 759 نقطه داده برای تجزیه و تحلیل باقی مانده است. شکل 1 مقادیر CQ اندازه گیری شده را در مقابل مقادیر مورد انتظار مولکول در هر نمونه (بالا) ترسیم می کند. داده ها به یک خط مستقیم نصب شده اند ، که با این حال ، فقط برای هدایت چشم است ، زیرا نمونه های غلظت کم خارج از محدوده خطی منحنی استاندارد qPCR هستند. شکل 1 همچنین مقادیر CQ اندازه گیری شده را در یک نقشه باقیمانده نسبت به خط مستقیم مجهز (پایین) نشان می دهد. توطئه ها نشان می دهد که چگونه گسترش تکرار با کاهش میزان هدف افزایش می یابد. این به دلیل سر و صدای نمونه برداری پیش بینی می شود. با کاهش تعداد مورد انتظار نسخه های هدف ، تغییرات در تکرار افزایش می یابد. اگرچه عوامل دیگر نیز به تغییر در بین تکرارها کمک می کنند [14] ، سر و صدای نمونه برداری ، که می تواند با توزیع پواسون مدل سازی شود ، انتظار می رود در تعداد کپی های بسیار کم حاکم باشد [15] ، [16]. در شکل 1 همچنین مشاهده می شود که نمونه های غلیظ کم با داشتن مقادیر CQ تا حدودی پایین تر از حد انتظار از خط مستقیم منحرف می شوند. این تعصب به دلیل برخی از نمونه های تکثیر منفی ("غیر آشکار") است و در توطئه ها در نظر گرفته نمی شود و در نتیجه CQ متوسط ظاهری پایین تر می شود.

Fig. 1

سری رقیق سازی استاندارد. بالا: رقت سریال 2 برابر یک نمونه DNA ژنومی انسانی کالیبره شده که دامنه آن را از 1 تا 2048 مولکول هدف به طور متوسط در هر نمونه پوشش می دهد. هر نمونه در 64 تکرار ، به جز رقیق ترین نمونه ، که در 128 تکرار ، با استفاده از روش qPCR معتبر مورد بررسی قرار گرفت ، مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. پایین: طرح باقیمانده از خواندن مثبت.

4- محدودیت تشخیص

LOD برای روش های qPCR را می توان از تجزیه و تحلیل منحنی های استاندارد تکثیر تخمین زد [10]. از تعریف LOD نتیجه می گیرد که کار با اطمینان 95 ٪ ، LOD غلظت اندازه گیری است که حداقل 95 ٪ تکرار مثبت را تولید می کند. در شرایط بدون خطا ، هنگامی که فقط نویز نمونه برداری به تکثیر تنوع کمک می کند ، LOD با اطمینان 95 ٪ 3 مولکول است [9]. برای اکثر نمونه های واقعی ، LOD همچنین تحت تأثیر سر و صدایی که توسط نمونه گیری ، استخراج ، رونویسی معکوس و qPCR به آن کمک می شود ، تحت تأثیر قرار می گیرد و ممکن است از نظر قابل ملاحظه ای بالاتر باشد. شکل 2 کسری از تکرار مثبت را در مقابل تعداد مولکول های هدف در هر نمونه برای داده های معتبر/gDNA ترسیم می کند. از بازرسی بصری ، LOD با اطمینان 95 ٪ بین 2 تا 4 مولکول هدف است. قرار دادن داده ها با عملکرد سیگموئیدی:

اجازه می دهد تا درون یابی ، که به LOD = 2. 5 مولکول هدف می دهد. این حتی کمی پایین تر از حد نظری ناشی از سر و صدای نمونه برداری است. دقت تخمین را می توان با استفاده مجدد از داده ها بدست آورد (شکل 2):

Fig. 2

حد تشخیص. کسری از خواندن مثبت به دست آمده با روش معتبر در هنگام تجزیه و تحلیل نمونه های حاوی 1 تا 2048 مولکول هدف به طور متوسط در هر نمونه. کسری اندازه گیری شده برای برآورد LOD (خط جامد) به یک منحنی سیگموئید تعبیه شده است. در 95 ٪ اعتماد به نفس LOD 2. 5 مولکول هدف است. بازگرداندن داده ها با عود (خط متراکم) اجازه می دهد تا فاصله اطمینان 95 ٪ برای LOD = 3. 7 ≤ 2. 5 2. 0 (تقاطع خط افقی در 0. 95 و سه منحنی سیگموئید) تخمین بزند.

فاصله اطمینان شامل LOD نظری 3 مولکول است.

5. حد کمیت

LOQ همچنین می تواند از منحنی های استاندارد تکثیر تخمین زده شود. این کار با محاسبه SD برای پاسخ نمونه های تکرار در غلظت های مختلف انجام می شود. SD از داده ها را می توان در هر دو ورود به سیستم (مقادیر CQ) یا مقیاس خطی (مقادیر نسبی) محاسبه کرد و توزیع خاصی را فرض نمی کند. در هر حالت ، SD نشان دهنده میانگین اختلاف مقادیر اندازه گیری شده به میانگین در همان مقیاس است. برخلاف SD ، محاسبه فاصله اطمینان ، توزیع عادی را فرض می کند. برای داده های توزیع شده به طور معمول ، انتظار می رود 68 ٪ از مقادیر اندازه گیری شده در میانگین 1 ± SD و 95 ٪ در میانگین SD 2 ± باشد. انتظار می رود SD با کاهش غلظت هدف به دلیل سر و صدای نمونه برداری افزایش یابد ، که به تنهایی SD از 0. 25 چرخه تولید می کند که میانگین تعداد مولکول های هدف در هر یک از آنالیزهای مورد تجزیه و تحلیل 35 باشد (شکل 3). در عمل ، عوامل دیگری مانند تلفات ناشی از جذب به سطوح ، کاهش بازده واکنش در غلظت های پایین تر ، واکنش های کم کارآمد و غیره ، به خطا کمک می کنند. محاسبه SD از داده های qPCR در مقیاس لگاریتمی ، یعنی در مقادیر CQ ، این مزیت را دارد که داده ها معمولاً توزیع عادی هستند و فواصل اطمینان به راحتی محاسبه می شوند. با این حال ، برای مقایسه با سایر تکنیک های اندازه گیری ، SD باید به مقیاس خطی تبدیل شود و در درصد میانگین بیان شود ، که به عنوان انحراف استاندارد نسبی یا ضریب تغییر (CV = 100 × SD/میانگین) شناخته می شود که منجر به آن می شودبیان زیر برای ضریب تغییر:

جایی که CVlnضریب تغییر برای داده های توزیع شده log-normal همانطور که انتظار می رود برای غلظت های اندازه گیری شده با qPCR ، دارای راندمان qPCR: E و انحراف استاندارد از ارزش های CQ: SD (CQ).

Fig. 3

SD به دلیل ابهام نمونه برداری. سهم در انحراف استاندارد از ابهام نمونه برداری که توسط توزیع پواسون مدل شده است. نمودار سمت چپ: توزیع مولکول های هدف در سطح مسافت از ظروف با غلظت های مختلف مدل شده توسط توزیع پواسون. نمودار سمت راست: SD از مقادیر CQ تکرار فرض خطای نمونه برداری را فقط با توزیع پواسون می توان مدل کرد. غلظت کانتینر 35 مولکول هدف به طور متوسط در هر یک از چرخه های SD = 0. 25 چرخه تولید می کند.

شکل 4 CV را برای نمونه های GDNA انسانی مورد سنجش AlityPrime به عنوان تابعی از تعداد مورد انتظار مولکول های هدف در نمونه های استاندارد نشان می دهد. CV با کاهش غلظت هدف همانطور که به دلیل افزایش نویز نمونه برداری و سایر عوامل انتظار می رود افزایش می یابد. با کاهش غلظت هدف ، برخی از نمونه های تکثیر منفی شروع می شوند ("غیر آشکار"). این غلظت ها در هر تعریف زیر LOQ است و در شکل 4 به رنگ قرمز نشان داده شده است. همچنین در SD محاسبه شده ، تعصب نسبت به مقادیر پایین تر وجود دارد ، زیرا نمونه های غیر جداگانه را نمی توان در نظر گرفت.

Fig. 4

حد کمیت. ضریب تغییر (CV = 100 × SD/میانگین) غلظت محاسبه شده پشتی نمونه های تکثیر ژنوم انسان با استفاده از روشهای معتبر. خط شکسته قرمز افقی نشان دهنده CV = 35 ٪ و خط شکسته سبز عمودی نشان دهنده کمترین غلظت نمونه ها با CV زیر 35 ٪ است. نمادهای قرمز حاکی از وجود نمونه های منفی ("غیر آشکار") در بین تکرارها است. این موارد هنگام محاسبه SD نادیده گرفته می شوند و منجر به تعصب نسبت به مقادیر SD پایین می شوند.

هیچ راهنمایی کلی وجود ندارد که ارزش آستانه قابل قبول LOQ را مشخص کند. آنچه ممکن است معقول باشد از موارد دیگر متفاوت است و به پیچیدگی نمونه ها و دقت لازم در هر تصمیم گیری که توسط آزمون پشتیبانی می شود بستگی دارد. در Tataa Biocenter ، مگر اینکه راهنمایی دیگری داشته باشیم ، LOQ را به عنوان کمترین غلظت مشخص می کنیم که در آن تکرار 35 ≤ CV در غلظت های محاسبه شده پشتی نشان می دهد. با استفاده از روش معتبر برای تجزیه و تحلیل gDNA انسانی ، می فهمیم که کمترین مقدار GDNA که با 35 ≤ CV تولید می کند ، 16 مولکول است. از این رو ، LOQ از روش معتبر همانطور که در اینجا اعمال می شود 16 مولکول است.

6. بحث

دقت برآورد LOD و LOQ در درجه اول به افزایش غلظت بین نمونه های استاندارد بستگی دارد ، در حالی که دقت در درجه اول به تعداد تکرار بستگی دارد. در حقیقت ، برآورد LOQ محدود به غلظت/مقادیر هدف است که در نمونه استاندارد موجود است. در مثال ما LOQ 16 مولکول است ، یا شاید کمتر از آن معیارهای CV ≤ 35 ٪ را برآورده کند ، اما به 8 مولکول نمی رسد ، که مقدار مولکول های هدف در نمونه استاندارد رقیق شده بعدی بود. ما در حال حاضر هیچ وسیله قابل اعتماد برای درون یابی CV در مقابل داده های مقدار هدف برای به دست آوردن تخمین LOQ که بین 8 تا 16 مولکول خواهد بود ، نداریم. تعداد تکرارهای انجام شده از هر نمونه استاندارد ، دقت در برآورد SD و CV را تعیین می کند. اگر اینها ضعیف باشند ، به دلیل تعداد کمی از تکرار ، معیارهای LOQ به طور تصادفی می توانند با غلظت متفاوتی که منجر به برآورد اشتباه می شود ، رعایت شود. گاهی اوقات CV با یک مقدار هدف خاص به آستانه تعیین شده (35 ٪ در مورد ما) افزایش می یابد ، سپس با مقدار هدف پایین تر به زیر این آستانه فرو می رود و دوباره افزایش می یابد. چنین نوسانات به دلیل عدم دقت در تخمین CV معمولاً به دلیل کمترین تعداد تکرار است. در این موارد ، LOQ باید به عنوان کمترین مقدار هدف بالاتر از هر غلظت با CV بیش از آستانه تنظیم شود. علاوه بر معیارهای فوق ، LOQ هرگز نمی تواند پایین تر از LOD باشد. در صورت آزمایش چنین تخمین ، LOQ باید برابر با LOD گزارش شود.

در مثال معتبر/GDNA ما ، LOD کمتر از 4 مولکول هدف است اما به 2 نمی رسد ، زیرا نمونه های استاندارد حاوی میانگین 4 مولکول هدف دارای میزان تماس مثبت بالاتر از 95 ٪ هستند ، در حالی که نمونه های استاندارد حاوی میانگین 2 مولکول هدفنرخ تماس مثبت زیر 95 ٪. با درون یابی نرخ تماس اندازه گیری شده به عنوان تابعی از میانگین تعداد مولکول های هدف ، ما یک تخمین دقیق تر از LOD به دست می آوریم. برای معتبر/gDNA ما LOD را با درون یابی به 2. 5 مولکول تخمین می زنیم. این نزدیک به LOD مورد انتظار با میزان تماس مثبت 95 ٪ از 3 مولکول پیش بینی شده توسط توزیع پواسون با توصیف نویز نمونه برداری است ، نشان می دهد که سایر کمک های مربوط به نویز برای تجزیه و تحلیل qPCR معتبر/gDNA qPCR ناچیز است.

اگر تعداد کافی از تکرار در غلظت هر استاندارد در دسترس باشد ، فاصله اطمینان از تخمین LOD را می توان با استفاده مجدد از داده ها با عود بدست آورد. تعداد نسبتاً بالایی از تکرار ، اغلب حداقل 20 ، در هر غلظت برای بدست آوردن همگرایی لازم است. فاصله اطمینان LOD نامتقارن است و دامنه کمتری به سمت غلظت هدف پایین تر دارد. برای روش معتبر تجزیه و تحلیل GDNA انسانی ، LOD برای 95 ٪ میزان تماس مثبت با محدوده اطمینان 95 ٪ تخمین زده می شود: LOD = 3. 7 مولکول 2. 5 2. 0 2. 0.

دامنه غلظت تحت پوشش نمونه های استاندارد تأثیر بسیار کمی بر تخمین LOD و LOQ دارد. برای برآورد LOQ ، فقط کمترین مقدار هدف با CV در زیر آستانه تنظیم شده و بالاترین مقدار هدف با CV بالاتر از آستانه تنظیم شده استفاده می شود. برآورد اولیه خشن LOD نیز فقط بر اساس دو نمونه است: نمونه با کمترین میزان هدف که خواندن مثبت را با نرخ بالاتر از معیارهای تعیین شده (به طور معمول 95 ٪) و نمونه با بالاترین میزان هدف که باعث ایجاد مثبت با سرعت می شود ، تولید می کند. در زیر معیارهای تعیین شدهیک تخمین دقیق تر از LOD را می توان با درون یابی نرخ مثبت اندازه گیری شده با در نظر گرفتن نمونه های استاندارد بیشتر بدست آورد. اما حتی در این حالت فقط تعداد کمی از نمونه های استاندارد در نظر گرفته شده است ، زیرا تنها مواردی که نرخ مثبت کسری را تولید می کنند (یعنی بالاتر از 0 و زیر 100 ٪) به میزان قابل توجهی در اتصالات نقش دارند. بنابراین ، از دیدگاه عملی و عملکرد هزینه ، بهتر است محدوده غلظت هدف استانداردها را محدود کنید تا فقط LOD و LOQ مورد انتظار را بپوشانید و تعداد تکرار را برای بهبود دقت افزایش دهید. در عمل ، LOD و LOQ پیش از آزمایش شناخته نشده اند. یک رویکرد عملی پس از آن ، به دست آوردن یک برآورد خشن اولیه از LOD و LOQ ، شاید به عنوان بخشی از منحنی استاندارد معمولی که هنگام ایجاد هر روش جدید برای برآورد راندمان PCR ، قابلیت تکرار و دامنه پویا اندازه گیری می شود و سپس در یک آزمایش دوم باریک است. دامنه غلظت را پایین بیاورید و تعداد تکرار را برای برآورد دقیق تر LOD و LOQ افزایش دهید.

تصدیق

این پروژه توسط Cz. 1. 05/1. 1. 00/02. 0109 Biocev ارائه شده توسط ERDF و MEYS و توسط پروژه IMI European Cancer-ID پشتیبانی شده است.

فارکس کاران ایران...
ما را در سایت فارکس کاران ایران دنبال می کنید

برچسب : نویسنده : ديناروند فهيمه بازدید : 66 تاريخ : جمعه 19 خرداد 1402 ساعت: 23:22